Adv. Sci.｜南医大倪春辉团队破局肺纤维化：锁定脂肪酸氧化与糖酵解 “失衡点”，挖掘关键治疗靶点

英文标题：Fatty Acid Oxidation-Glycolysis Metabolic Transition Affects ECM Homeostasis in Silica-Induced Pulmonary Fibrosis

中文标题：脂肪酸氧化-糖酵解代谢转换影响二氧化硅诱导的肺纤维化中细胞外基质稳态

发表期刊：Advanced Science

影响因子：14.3

客户单位：南京医科大学

百趣提供服务：新一代代谢组学NGM 2

肺纤维化是慢性致命性疾病，长期接触二氧化硅粉尘可引发硅肺，是常见且严重的职业病，给个人和社会带来沉重负担。纤维化以成肌纤维细胞异常增殖和细胞外基质(Exracellular Matrix, ECM)过度产生为特征。代谢重编程在肺纤维化中起重要作用，糖酵解和脂肪酸氧化(Fatty Acid Oxidation, FAO)代谢紊乱可能影响ECM的平衡，但具体机制不明。本研究旨在探究其机制，并评估针对调控相关代谢途径和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的治疗潜力。

1、小鼠肺纤维化的发生伴随着细胞代谢的重构

为分析二氧化硅刺激后的细胞代谢状态，构建经气管内单次滴注二氧化硅悬液的小鼠模型，于暴露后7天、14天、28天收集肺组织。H&E染色结果（图1A）显示，随硅肺进展，肺部炎症和纤维化程度逐渐加重。羟脯氨酸测定表明，肺组织胶原水平随二氧化硅暴露时间延长显著升高（图1B）。在硅肺进展过程中，细胞外基质成分（如纤维连接蛋白、胶原蛋白 I、弹性蛋白）的蛋白质水平通过Western blot检测呈时间依赖性增加（图1C）。为进一步明确胶原沉积形式，对肺组织病理切片进行Masson染色、天狼星红染色及偏振光成像，结果显示纤维化肺组织中胶原纤维大量沉积，结构紊乱且以不溶性胶原为主（图1D）。

为深入探究代谢重构机制，进一步开展转录组和代谢组分析。代谢组学分析（图1E）显示，肺纤维化小鼠肺组织中糖酵解中间产物（如3-磷酸甘油酸、葡萄糖-6-磷酸、磷酸烯醇丙酮酸）含量显著增加，而FAO相关代谢物（如3-羟基丁酸、L-肉碱、硬脂酰肉碱）水平降低，提示糖酵解增强、FAO 减弱的代谢表型。Western blot检测（图1F）进一步证实，糖酵解关键蛋白（HIF-1α、己糖激酶2(HK2)、葡萄糖转运蛋白3(GLUT3)、磷酸果糖激酶2(PFK2)）表达上调，而FAO调控蛋白（肉碱棕榈酰转移酶1a(CPT1a)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、PPAR-α水平显著下降，与转录组和代谢组结果一致。

2、活化的成纤维细胞通过糖酵解和FAO的代谢扰动实现ECM的沉积

为探究成纤维细胞活化与代谢转变的关联，通过转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导建立MRC-5成纤维细胞活化模型。结果显示，随TGF-β1浓度增加，α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原mRNA水平显著升高（图2A）。Western blot和免疫荧光分析表明，活化细胞中纤维连接蛋白、胶原蛋白I、弹性蛋白等ECM 蛋白表达显著增加（图2B-C）。线粒体荧光探针(Mito-Tracker)标记显示，TGF-β1处理后线粒体信号强度显著减弱，提示线粒体功能受损（图2D）。同时，能量稳态核心调控因子AMP激活蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平(p-AMPK)显著下降（图2E），进一步表明代谢状态异常。

qRT-PCR和Western blot显示，活化成纤维细胞中糖酵解关键基因(HIF-1α、HK2、PFK2)及蛋白表达上调，而FAO相关基因(CPT1a、PPAR-γ)及蛋白水平下调，与硅肺小鼠肺组织中的代谢表型一致。细胞代谢功能检测（ECAR和OCR）证实，活化细胞糖酵解能力增强，FAO水平降低（图2H-I）。综上，肺纤维化发展与成纤维细胞中FAO下调、糖酵解上调的代谢扰动密切相关。

3、抑制糖酵解或增强FAO会影响活化成纤维细胞中的ECM沉积

为探究代谢干预对ECM沉积的影响，使用糖酵解抑制剂3PO或FAO激活剂吡格列酮处理TGF-β1活化的成纤维细胞。结果显示，两种干预均能显著减少ECM蛋白（纤维连接蛋白、胶原I、弹性蛋白）的表达（图3A）。免疫荧光染色表明，3PO处理导致细胞外胶原I荧光信号减弱，而吡格列酮处理则使细胞内胶原I信号降低（图3B），提示两者通过不同机制影响胶原分布。进一步分析显示，抑制糖酵解可减少不溶性ECM，同时增加培养基中可溶性胶原含量（图3C-D），伴随赖氨酸氧化酶(LOX)活性降低和甘氨酸合成减少（图3E-F）；而增强FAO对ECM溶解度无显著影响，但可促进溶酶体与胶原的共定位（图3G），并增强外源性DQ-胶原的内吞降解（图3H）。综上，抑制糖酵解通过削弱ECM合成与修饰发挥作用，增强FAO则通过促进细胞内降解途径抑制ECM沉积，两者均能有效抑制纤维化相关ECM积累。

4、抑制糖酵解和增强脂肪酸氧化在体内的干预和治疗效果

为验证代谢干预的体内疗效，构建二氧化硅诱导的肺纤维化小鼠模型，分别在暴露后立即（干预组）或纤维化形成后（治疗组）给予糖酵解抑制剂3PO或FAO激活剂吡格列酮。干预结果（图4A-B）显示，暴露后立即给药可显著减轻肺泡结构破坏和肺纤维化程度，Masson染色和天狼星红染色显示Ⅰ型胶原、纤维连接蛋白等ECM沉积显著减少。然而，3PO干预组肺组织仍存在羟脯氨酸阳性染色（图4B），提示残留胶原降解不完全；吡格列酮干预组则通过CHP染色显示细胞内胶原降解信号增强（图4D），表明其促进ECM内吞降解的作用。

治疗效果（图5A-B）显示，对已形成的纤维化（造模28天后给药），吡格列酮仅部分缓解胶原沉积，而3PO可减轻肺损伤但仍有胶原碎片残留。Western blot证实，两种干预均能下调纤维连接蛋白、胶原I、弹性蛋白的表达（图5C）。CHP染色（图5D）进一步显示，3PO治疗组肺组织中CHP荧光强度较低，提示变性胶原减少；而吡格列酮组CHP信号较强且集中于细胞核周围，表明其促进胶原内吞降解的作用。然而，羟脯氨酸染色与CHP结果不完全一致，可能因前者检测完整胶原，后者特异性结合变性胶原，提示两种药物对ECM的作用路径不同：3PO主要抑制胶原合成，吡格列酮则通过增强FAO促进胶原的细胞内降解。

5、HIF-1α调节成纤维细胞中脂肪酸氧化-糖酵解的转化

为解析单一代谢干预的复杂效应，研究发现：3PO抑制糖酵解可显著增加耗氧率(Oxygen Consumption Rates, OCR)，提示FAO代偿性激活；而吡格列酮增强FAO仅轻度减少细胞外酸化率(Extracellular Acidification Rates, ECAR)，糖酵解未显著受抑。这表明，单独干预糖酵解或FAO会引发难以预测的代谢补偿，因此筛选调控双代谢途径的核心因子尤为重要。

转录组分析显示，HIF-1α在纤维化肺组织中显著上调。进一步实验（图6B-C）显示，在TGF-β1诱导的成纤维细胞活化模型中，HIF-1α mRNA和蛋白水平均呈时间依赖性升高：刺激24小时后，HIF-1α mRNA表达增加2.3倍（图6B），蛋白水平在48小时达到峰值（图6C），且其降解被环己酰亚胺(CHX)抑制，提示TGF-β1通过延长蛋白半衰期增强HIF-1α稳定性。免疫组化证实，特发性肺纤维化(IPF)和硅肺患者的纤维化区域中，HIF-1α表达上调，而FAO关键转录因子PPAR-γ表达下调，且两者在小鼠硅肺模型中呈现一致趋势（图6A）。

机制研究表明，TGF-β1通过抑制HIF-1α泛素化，在常氧条件下稳定其蛋白水平。进一步功能实验显示，敲低HIF-1α可逆转TGF-β1诱导的糖酵解增强（ECAR降低）和FAO减弱（OCR恢复），并恢复线粒体数量及AMPK活性（图6D-H），证实HIF-1α是调控FAO-糖酵解代谢切换的核心分子。

6、HIF-1α抑制通过调节糖酵解-FAO代谢紊乱减少ECM沉积

为探究抑制HIF-1α能否通过调控糖酵解-FAO代谢失衡增强ECM清除，在MRC-5细胞中敲低HIF-1α，结果显示ECM相关蛋白（如纤维连接蛋白、胶原I）表达显著降低（图7A）。免疫荧光证实，胞内及胞外胶原I荧光强度均显著减弱（图7C），表明HIF-1α抑制可有效减少体外TGF-β1诱导的ECM沉积。

机制研究发现，敲低HIF-1α后，胶原编码基因（如 COL1A1）转录水平未显著改变（图7B），但ECM修饰酶(LOX、LOXL2、P4AH1、PLOD1、PLOD2)的mRNA 水平显著下调（图7D），伴随LOX酶活性降低和可溶性胶原增加（图7F）。此外，成纤维细胞对DQ-胶原的内吞效率及溶酶体共定位显著增强（图7G-I），提示ECM交联减少且降解途径激活。

7、抑制HIF-1α调节的脂肪酸氧化-糖酵解代谢扰动在体内减轻肺纤维化

为验证HIF-1α抑制的体内治疗效果，在二氧化硅粉尘滴注后的第二天或已形成纤维化的小鼠（造模28天后），分别用两种代谢调节剂（3PO联合吡格列酮）或一种HIF-1α抑制剂(LW6)处理小鼠，以评估干预或治疗效果（图8A和图9A）。

对小鼠肺组织进行的H&E染色显示，LW6组和3PO联合吡格列酮组小鼠的肺部纤维化程度有所减轻。此外，Masson染色和羟脯氨酸免疫组化结果表明，小鼠肺组织中的胶原沉积相对减少。同时，天狼星红染色显示胶原沉积减少，偏振光显微镜观察发现，LW6组和3PO联合吡格列酮组中复杂且紧密堆积的胶原减少（图8B和图9B）。Western blot结果显示，LW6组和3PO联合吡格列酮组中纤连蛋白、I型胶原和弹性蛋白的表达下调（图8C和图9C）。与此一致的是，研究者发现纤维化病变的严重程度和位置有了明显改善（图8D和图9D）。这些结果表明，在体内抑制HIF-1α调控的代谢转变能够有效减少暴露于二氧化硅粉尘的小鼠肺部ECM的过度沉积。

本研究发现，在二氧化硅诱导的肺纤维化中，糖酵解增强和FAO减少，促使细胞外基质合成与降解失衡，推动疾病发展。HIF-1α在调节FAO-糖酵解代谢转换、影响ECM重塑方面至关重要。因此，代谢疗法或靶向HIF-1α有望成为清除纤维化ECM、改善肺功能的有效策略。